Isolement & clonage du gène

On a localisé l'ARNm mais on n'a pas encore "le gène entre les mains". On a découvert que certains virus n'ont comme matériel génétique que de l'ARN, ce cas est d'ailleurs propre aux rétrovirus. Et comme tous les virus, il a besoin d'une cellule hôte pour se reproduire. Quand il infeste une cellule, le rétrovirus libère son ARN et grâce à une enzyme, la transcriptase inverse, il va "traduire" son ARN en ADN ! On va alors enlever notre sonde puis avec l'enzyme transcriptase inverse, on va pouvoir produire l'ADN de notre gène.

On a eu du mal à trouver ce gène thérapeutique, il n'est alors pas question pour nous de le perdre. Pour éviter toute disparition impromptue, il vaut mieux faire des copies de ce gène, et ce à l'aide du fort pouvoir de multiplication qu'a la bactérie. Pour cela, on va se servir des plasmides. Les plasmides sont de petites molécules d'ADN circulaires qui ont la capacité de s'autorépliquer. Mais aussi, et c'est ce qui nous intéresse, les plasmides sont indépendants de la cellule qui les transporte, même si elles lui sont souvent très utiles. Elles sont indépendantes dans le sens où elles peuvent "sauter" d'une cellule à une autre assez facilement. On va donc ouvrir le plasmide à l'aide d'une enzyme de restriction à un seul endroit. Les enzymes de restriction coupent très spécifiquement une molécule d'ADN. Dans notre cas, on va la faire couper de telle manière qu'il reste un simple brin à chaque bout du plasmide, ce qui forme deux extrémités cohésives [voir schéma]. Il nous suffira de rajouter au bout de notre gène les même extrémités pour qu'il se fixe naturellement (à l'aide d'enzyme ADN-ligase) aux deux bouts du plasmide, qui sera ainsi refermé. Il nous reste alors à mettre notre bactérie en culture dans des conditions optimales pour obtenir une véritable "banque génomique". (Une bactérie peut dans les meilleures conditions se diviser toutes les 20 minutes. C'est à dire qu'en une heure on se retrouverait avec 2³=8 bactéries et en 1 jour : 2^3x24= 4 722 366 482 869 645 213 696 bactéries (soit 4 722 milliards de milliards de bactéries). Si ces conditions se maintenaient, on obtiendrait, en moins de deux jours, une masse équivalente à celle de la Terre.)

ï Localisation du gène de nécessité ó Production de la protéine thérapeutique ex-vivo ð